Cómo propagar y cultivar marihuana in vitro

Micropropagación cannábica: método, ventajas y desventajas

Por Eric Turiansky. Fotos: Emilio Alix.

La técnica de propagación conocida como cultivo de tejidos, cultivo in vitro o micropropagación es una de las más prometedoras en ofrecer soluciones prácticas para la agroindustria del cannabis.

Micropropagación de la marihuana

La micropropagación, que empezó a desarrollarse hace un siglo aproximadamente, es el cultivo de tejidos vegetales in vitro. Esto quiere decir que podemos partir de una porción muy pequeña de una planta, sea un meristema, una nervadura, un fragmento de hoja (tejidos organizados) o tejidos indiferenciados como callos, suspensiones celulares y protoplastos en condiciones de asepsia, sobre medios nutritivos apropiados y en ambientes controlados para desarrollar una planta completa.

Con esta técnica podemos obtener un doble beneficio ya que por un lado nos aporta el potencial de generar una cantidad enorme de clones y desarrollarlos jugando con el aporte artificial de fitohormonas que la planta tiene normalmente, direccionando ese crecimiento hacia la rizogénesis o al desarrollo de partes aéreas.

De esta forma podemos conseguir una gran cantidad de plantas genéticamente idénticas en un periodo muy corto de tiempo. Partiendo de un meristema apical el crecimiento es exponencial, porque vamos a ir subdividiendo los plantines a medida que estos crecen y en seis meses podemos obtener 200.000 clones, a la vez que en el proceso vamos a lograr sanearlos, de ser necesario.

La micropropagación se ha convertido en un pilar fundamental en la producción de plantas en masa, ya que ofrece varios beneficios significativos.

Permite la clonación exacta de plantas de elite selectas, algo esencial en cultivos de alto valor como el cannabis, donde se buscan variedades específicas con características deseables, como el quimiotipo (contenido de cannabinoides), la presencia de tal o cual terpeno, la resistencia a enfermedades, la arquitectura de las plantas y la duración de la fase reproductiva entre otros.

Todas características fundamentales a la hora de planificar las labores de la producción agrícola como el marco de plantación, la densidad, el control de plagas, la trazabilidad, la homogeneidad del cultivar y el momento de la cosecha.

Por otro lado nos ofrece una alternativa muy práctica para la conservación de plantas madre ya que en un metro cúbico podemos almacenar unas 20.000 variedades y de esta forma poder obtener siempre clones de la planta madre original evitando así el desgaste que se genera al realizar clones de clones de clones. Un Banco de Germoplasma dedicado a cannabis podría almacenar todas las variedades en un laboratorio suficientemente equipado.

Y por último, nos da la posibilidad de recuperar la salud de una variedad que esté afectada por algún patógeno. Hay plantas que tienen algunas enfermedades, sean virosis o bacteriosis endógenas que con el cultivo de tejidos podemos “limpiar” o sanearlas, o sea que es una técnica con un enorme potencial que también genera, al menos en lo que venimos probando e investigando en cannabis y en otros cultivos, mayor vigor en el crecimiento de las plantas en comparativa con la propagación por estacas (gajos).

La microporagación de la marihuana se basa en los mismos principios que la propagación vegetativa tradicional (totipotencia y la capacidad de desdiferenciación y rediferenciación de las células vegetales) pero supone una miniaturización del proceso.

Ventajas de la Micropropagación in vitro de la marihuana

La micropropagación de marihuana permite la producción de grandes cantidades de plantas en un período de tiempo sorprendentemente corto, acelerando la respuesta a la demanda del mercado.

Cada planta de cannabis obtenida mediante micropropagación es una copia exacta de la planta madre, lo que garantiza la preservación de características deseables.

La técnica es vital para la conservación de especies amenazadas y la preservación de la diversidad biológica. Permite la conservación de germoplasma por mucho tiempo y a bajo costo.

La esterilidad del proceso reduce el riesgo de transmisión de patógenos y enfermedades, lo que resulta en plantas más saludables. El proceso también da independencia de las condiciones ambientales externas.

También podemos transportar material sin ocupar demasiado lugar y nos da la posibilidad de intercambios internacionales sin problemas cuarentenarios.

Desventajas de la Micropropagación in vitro de la marihuana

La inversión en infraestructura y equipos para llevar a cabo la micropropagación de cannabis puede ser alta. La mano de obra capacitada representa entre el 40% y el 60% del costo total. También es necesaria una rigurosa planificación que requiere de organización y control de las tareas que demanda.

La técnica es altamente sensible a la contaminación microbiana, lo que requiere un control meticuloso del ambiente de trabajo, de lo contrario las pérdidas pueden ser considerables. Otro inconveniente es el Potencial de Variabilidad Genética Limitada. La clonación exacta puede ser una desventaja si se necesita diversidad genética para adaptarse a cambios ambientales.

Otro punto desfavorable de la microporapagación es que requieren rustificación. Es decir en la exposición del material a las condiciones ambientales en forma gradual, hasta que las plantas están listas para su implantación. Son las dificultades en el pasaje de in vitro a ex vitro.

A medida que la micropropagación se arraiga en la agricultura y la horticultura, su impacto en la producción de plantas de alta calidad es innegable. Con un crecimiento constante en su aplicación, esta técnica promete revolucionar la forma en que cultivamos y conservamos plantas, al tiempo que garantiza una producción más eficiente y sostenible.

Desde el cultivo de cannabis hasta la preservación de especies en peligro, la micropropagación está abriendo nuevas puertas en la ciencia de la propagación de plantas.

Instalaciones mínimas para cultivar marihuana in vitro

Las instalaciones mínimas para micro propagar son un lugar físico compartimentalizado en secciones. Los laboratorios deben disponer de todos los servicios: agua corriente (fría y caliente), energía eléctrica y gas.

La sala para la preparación de los medios de cultivo se requiere para la limpieza y esterilización del material vegetal a “sembrar“ y del material de vidrio e instrumental, etc. En ese recinto se ubican la mayoría de los equipos y el mobiliario necesario para trabajar cómodamente y mantener el lugar en orden. Por ejemplo, mesadas amplias, alacenas, bajo mesadas, vitrinas para droguero, etc.

En la sala de trabajo en condiciones de esterilidad o área de transferencia se manipula el material vegetal estéril, se hacen las “siembras” los repiques y subcultivos, etc. Allí se debe ubicar la cabina de flujo laminar, equipo fundamental para la micropropagación.

En el cuarto de cultivo se produce el crecimiento y desarrollo de los explantos en sus distintas etapas. Las condiciones ambientales están controladas y se adecuan a cada especie, tipo de explanto, etapa del cultivo, etc. Lo más habitual es controlar la temperatura, la humedad relativa y el fotoperiodo. En el invernáculo se logra la adaptación gradual al ambiente exterior o ex vitro.

Equipos e instrumental para cultivar marihuana in vitro

Para la micropropagación de cannabis se requieren equipos diversos como autoclave, estufa de esterilización, balanza analítica, peachímetro, destilador de agua, microscopio estereoscópico, microondas, freezer, heladera e instrumental como bisturís, pinzas, espátulas y agujas de disección, entre otros.

Insumos para cultivar marihuana in vitro

También son necesarios los componentes de los medios nutritivos (sales minerales, vitaminas, reguladores del crecimiento, hormonas, etc), material de vidrio variado, película plástica para tapar los recipientes de cultivo, película de aluminio, filtros de membrana con diámetro de poro de 0,22 micrones, sustancias de limpieza y desinfectantes y elementos de limpieza como cepillos.

Medio de cultivo de la marihuana in vitro

Los explantos de marihuana van a crecer en un medio que tiene disponible una serie de constituyentes inorgánicos que son todos los macro y micro nutrientes que requiere el vegetal y están presentes en todos los medios de cultivo.

En general, un medio nutritivo debe contener constituyentes inorgánicos, que se agrupan en macronutrientes (N, P, K, Ca, Mg y S) y micronutrientes (Fe, Mo, Bo, Zn, Co y Mn). Estos constituyentes se aportan en forma de sales solubles.

También constituyentes orgánicos. Los más importantes son: hidratos de carbono que constituyen la fuente de energía para el cultivo (ya que no van a hacer fotosíntesis durante el proceso) y ayudan a mantener el potencial osmótico del medio al mínimo. El más utilizado es sacarosa (2-4%). Con menos frecuencia se emplean otros como la fructosa, glucosa,etc.

Las vitaminas, son constituyentes que incluyen la tiamina (esencial para estimular procesos de crecimiento), el ácido nicotínico, la piridoxina, el mío-inositol (azúcaralcohol), el ácido pantoténico, el ácido fólico o la riboflavina, entre otros.

También son necesarios los aminoácidos. La glicina es de uso frecuente en los medios de cultivo. Sólo en ciertos casos se agregan metionina, arginina, etc.

La preparación del medio va a determinar el tipo de desarrollo que vamos a obtener. En general se usan dos tipos de reguladores del crecimiento (hormonas), las auxinas y las citoquininas. La relación entre estas, cuando preparamos el medio, es lo que va a estimular el tipo de crecimiento que deseamos para nuestras plantas (brotes aéreos o raíces).

Una relación favorable a las auxinas inducen la rizogénesis y por el contrario una mayor concentración de citoquininas favorece el desarrollo de brotes. Las auxinas más utilizadas son el IBA, AIA y ANA en concentraciones que oscilan entre 0,1 y 10 ppm y las citoquininas como la BAP, la zeatina y el thidiazuron son los más utilizados. El Ácido Giberélico (GA) se emplea para obtener el alargamiento de entrenudos.

También serán importantes el agua bidestilada. O desmineralizada y luego destilada

Y antibióticos. Ya que algunas plantas tienen infecciones con bacterias endógenas que no se eliminan con la desinfección superficial y pueden aparecer incluso después de varios sub cultivos. Por eso, en ciertos casos se hacen cultivos previos del explanto sobre medios con un antibiótico (penicilina, estreptomicina, gentamicina, ampicilina) o mezclas de ellos, a fin de limpiar el material. Del mismo modo, pueden emplearse sustancias fungicidas.

Procedimiento para micropropagación del cannabis

El medio de cultivo se prepara a partir de “soluciones madres” suele utilizarse el Murashige Skoog (MS), las soluciones madres de las sales se pueden guardar en heladera; en cambio, las de vitaminas y hormonas deben guardarse en el freezer, descongelándose lentamente bajo agua corriente cada vez que se van a usar.

Una vez mezclados todos los componentes. Se ajusta el pH entre 5 y 6, el pH óptimo depende de la especie cultivada. Sin embargo, también es necesario el ajuste para la correcta solidificación del agar (agente gelificante). Una vez ajustado el pH se incorpora el agar lentamente y se somete a “baño María” o microondas hasta que el medio esté traslúcido. Posteriormente, se distribuye en los recipientes de cultivo, se deja enfriar, se tapa y esteriliza.

La esterilización es vital para el éxito en esta tarea, las principales fuentes de contaminación pueden ser el material vegetal, el medio de cultivo, el operador y el instrumental. Por eso es importante, cuando estemos en el cuarto de siembra, el uso de guantes, barbijos, cofia, desinfección del calzado, etc.

Una vez montado nuestro laboratorio de micropropagación comenzamos con el proceso en la sala para la preparación de los medios de cultivo, esterilizando el material vegetal. Previamente vamos al invernadero y obtenemos el material que vamos a propagar, en el caso del cannabis vamos a utilizar las yemas apicales y axilares, es deseable que las plantas madres estén en fase vegetativa y preferentemente que estén en óptimas condiciones de salud e hidratación, el material vegetal se somete primero a un lavado con agua destilada con DG6, luego con etanol al 70% y por último en una solución con hipoclorito de sodio y Twin 20 (detergente). Por último, ya en la sala de trabajo estéril se enjuaga el material vegetal con agua destilada entre tres y seis veces.

En la sala de trabajo estéril solemos estar en un flujo alminar frontal y contamos con todos los elementos que vamos a necesitar: platos de metal, pinzas, bisturí, tubos de ensayo de base plana o frascos de vidrio con el medio de cultivo, agua esterilizada, marcador para rotular y esterilizador de herramientas.

Colocamos las estacas en un plato de metal esterilizado y con el bisturí cortamos los explantos con una yema, Luego colocamos las yemas, respetando la polaridad en el tubo o frasco, sin que toque los laterales, sumergido en el medio y la yema sin estar en contacto con el mismo. Cubrimos la abertura con el film, rotulamos con nombre y fecha y lo llevamos a la “cámara de crecimiento”. Es importante esterilizar o cambiar las herramientas (piensa y bisturí) por cada variedad que vamos a propagar.

La temperatura óptima en la sala de crecimiento es de 24 °C, después de tres o cuatro semanas en el “medio 1”, que induce el desarrollo de brotes, pasamos al ”medio 2” para la inducción de raíces, hoy es posible realizar este paso directamente en un sustrato como si de propagación tradicional se tratara.

Durante todo el proceso las plantas pierden la cutícula, sin esta capa protectora que se encuentra en la superficie externa de las plantas los clones no sobrevivirían si las pasamos directamente a la sala de cultivo o a campo, por ello es indispensable realizar un procedimiento de rustificación, que consiste en ir exponiendo al material a las condiciones ambientales en forma gradual hasta que las plantas están listas para su implantación en su marco de plantación.

Existen otros tratamientos que se utilizan en función de las necesidades, en algunos casos el cultivo in vitro por sí solo no es capaz de limpiar virus o microplasmas a un clon; por ello las plantas donantes se someten a termoterapia. La termoterapia consiste en someter a la planta a temperaturas de 35 a 38 °C por un periodo de entre 7 y 30 días, antes de la extracción de los memeristemas. Las plantas logradas debe pasar diferentes pruebas para constatar la limpieza.

Cuando los microbrotes desarrollaron el sistema radical deben transferirse a contenedores con sustratos estériles adecuados y rustificados o aclimatados en condiciones ambientales no controladas. El pasaje de un ambiente controlado, a otro ambiente no controlado debe hacerse en forma paulatina a través de un proceso de aclimatación en el que se va exponiendo a las plantas a las condiciones de ambiente por períodos cortos de tiempo hasta que la cutícula vuelve a formarse y de esta forma nuestras plantas están listas, ahora sí, para ser trasplantadas a la sala de cultivo, en invernáculo o a campo. Durante todo el proceso desde la introducción del explanto hasta el momento de la rustificación las plantas van a estar en un ambiente controlado con alta humedad.

En resumen, para tener éxito en este tipo de multiplicación se debe tener en cuenta el estado fisiológico de la planta donadora de explantos, el tipo de explanto empleado, la buena desinfección del explanto y de todo lo que está en contacto con él, la correcta selección de los componentes del medio nutritivo y su concentración para cada etapa de cultivo, el mantenimiento de las plantas las condiciones ambientales adecuadas, tanto al iniciar el cultivo como durante cada fase. Y el logro de un sistema de aclimatación eficaz, a fin de disminuir la mortalidad en el final del proceso.

Es perfectamente posible realizar esta metodología de propagación en forma casera, teniendo los conocimientos necesarios podemos reemplazar el autoclave, que se usa para esterilizar, por una olla a presión y el flujo laminar puede ser reemplazado por un mechero y trabajar en el cono de esterilidad.

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