227 terpenów w konopiach. Dlaczego każda odmiana pachnie inaczej?

Najbardziej kompleksowa mapa syntaz terpenowych u Cannabis sativa

Badanie, opublikowane w czasopiśmie Acta Pharmaceutica Sinica B, połączyło sekwencjonowanie genetyczne, pomiary terpenów, analizę ekspresji genów oraz testy laboratoryjne pojedynczych enzymów. Zdaniem badaczy praca ta dostarcza najbardziej kompleksowej jak dotąd funkcjonalnej mapy systemu syntaz terpenowych u Cannabis sativa.

Terpeny: od cytrusów po ziemiste nuty i ich naukowe znaczenie

Terpeny to związki aromatyczne odpowiedzialne za większość charakterystycznego zapachu marihuany, od cytrusowych i sosnowych po kwiatowe, korzenne i ziemiste aromaty. Są one również przedmiotem zainteresowania naukowego, ponieważ badacze postulowali, że niektóre z nich mogą wpływać na działanie kannabinoidów, choć zakres i kliniczne znaczenie takich interakcji pozostają w trakcie badań.

227 wykrytych terpenów: gdzie i kiedy roślina je produkuje?

Badacze przeanalizowali 28 próbek obejmujących różne tkanki, etapy rozwoju i sześć kultywarów konopi. Wykryli 227 lotnych terpenów konopnych, w tym 88 monoterpenów i 139 seskwiterpenów.

Rozkład tych związków istotnie różnił się w zależności od miejsca i czasu pobrania próbki z rośliny. Kwiaty i przysadki były głównymi „gorącymi punktami" produkcji terpenów, podczas gdy korzenie i dojrzałe nasiona nie zawierały ich niemal wcale. W kultywarze Dinamed Kush badacze wykryli zaledwie jeden lotny terpen w korzeniach i trzy w dojrzałych nasionach. Profile terpenowe zmieniały się również w miarę przechodzenia roślin z wczesnych do późniejszych etapów kwitnienia.

Różnice między odmianami były równie wyraźne. Chociaż sześć odmian wytwarzało ogólnie zbliżoną liczbę lotnych terpenów, ich szczególne mieszaniny różniły się na tyle, że tworzyły rozpoznawalne chemiczne „odciski palców".

Dominujące terpeny i specyfika poszczególnych kultywarów

Wśród wszystkich kultywarów pięć najbardziej rozpowszechnionych terpenów to: beta-mircen, trans-beta-ocymen, terpinolen, (−)-beta-pinen i alfa-pinen. Niektóre kultywary wyróżniały się szczególnie wysokimi stężeniami konkretnych związków: Red Pure wiązano z podwyższonym poziomem beta-mircenu i terpinenu, George Gloria z guaiolem i kamfenem, a Dinamed Kush z kariofilenem i humulenem.

Badacze stwierdzili obecność 33 podstawowych lotnych terpenów we wszystkich sześciu kultywarach, podczas gdy 60 wykryto wyłącznie w pojedynczych kultywarach, co podkreśla zarówno wspólny konopny fundament terpenowy, jak i znaczną różnorodność specyficzną dla danej odmiany.

Jeden szczególnie wyraźny przykład dotyczył trans-beta-ocymenu. Związek ten był wyraźnie obecny w kilku kultywarach, ale występował na bardzo niskich poziomach w odmianie Painkiller. Badacze powiązali tę różnicę z genem syntazy terpenowej, którego ekspresja była około 20-krotnie niższa w Painkiller niż w pozostałych pięciu kultywarach, co dostarczyło bezpośredniego powiązania między aktywnością genu a wynikowym profilem terpenowym.

Od genów do enzymów: złożoność systemu syntaz terpenowych

Analiza genetyczna ujawniła również znacznie większą złożoność niż proste posiadanie jednego genu dla każdego terpena.

Badacze początkowo zidentyfikowali 56 potencjalnych genów syntaz terpenowych w dwóch oddzielnie zsekwencjonowanych kopiach, czyli haplotypach, genomu Dinamed Kush. Po wykluczeniu niekompletnych lub skróconych sekwencji zidentyfikowano 41 wysokopewnych, pełnodługościowych genów syntaz terpenowych. Obejmowały one 18 genów z rodziny TPS-b, która jest głównie związana z produkcją monoterpenów, oraz 14 genów z rodziny TPS-a, obejmującej wiele syntaz seskwiterpenowych.

Wiele z tych genów występowało w skupiskach powstałych w wyniku duplikacji genów. Jeden region sam w sobie zawierał klaster 12 genów TPS-b2 w obrębie około 480 000 par zasad DNA. Badacze stwierdzili istotne różnice w liczbie i układzie genów między dwiema kopiami genomu konopi, co sugeruje, że konkretne warianty genetyczne odziedziczone przez roślinę mogą pomagać w określaniu jej zdolności do produkcji terpenów.

Różnica ta była szczególnie widoczna w przypadku jednego genu, CsTPS3DK. Chociaż wykazywał on duże podobieństwo do wcześniej zidentyfikowanej funkcjonalnej syntazy terpenowej i był eksprymowany na stosunkowo wysokim poziomie w kwiatach konopi, badacze stwierdzili, że jedna wersja brakowała krytycznego motywu cząsteczkowego niezbędnego do funkcji enzymatycznej. W rezultacie gen ten był faktycznie nieaktywny. Zdaniem badaczy odkrycie to ilustruje, dlaczego samo ustalenie, czy gen związany z terpenami jest obecny lub eksprymowany, może nie wystarczać do przewidzenia, jakie związki roślina faktycznie produkuje.

Analiza ekspresji genów dodatkowo zidentyfikowała 15 genów syntaz terpenowych, które były stale aktywne w kwiatach i przysadkach we wszystkich kultywarach, co sugeruje, że konopie posiadają zachowany podstawowy program wytwarzania kwiatowych terpenów. Inne geny różniły się dramatycznie między kultywarami, w tym przykłady z ponad 100-krotnymi różnicami w ekspresji.

Powiązania metaboliczne: terpeny i kannabinoidy działają wspólnie

Badacze znaleźli również dowody na to, że produkcja terpenów i kannabinoidów jest ściśle powiązana na poziomie metabolicznym. Analiza sieciowa zidentyfikowała 3496 genów silnie skorelowanych z co najmniej jednym terpenem, w tym 18 genów syntaz terpenowych, siedem genów związanych z terpenami znajdujących się wyżej w szlaku metabolicznym, 159 czynników transkrypcyjnych i 11 genów szlaku kannabinoidowego.

Kannabinoidy i monoterpeny współdzielą część tego samego aparatu biochemicznego, w tym prekursor geranylopirofosforan (GPP). Badacze zaobserwowali skoordynowaną aktywność genów szlaku terpenowego i kannabinoidowego w kwiatach, przysadkach i włoskach gruczołowych, czyli strukturach produkujących żywicę, gdzie kumuluje się wiele z tych związków.

Funkcjonalne testy enzymów: elastyczność syntaz terpenowych

Aby ustalić, co faktycznie robią poszczególne geny syntaz terpenowych, badacze funkcjonalnie przetestowali sześć wcześniej niescharakteryzowanych enzymów, wykorzystując inżynieryjne szczepy E. coli zaopatrzone w prekursory terpenów.

Eksperymenty ujawniły zaskakująco elastyczne enzymy zdolne do wytwarzania wielu związków, a w niektórych przypadkach wykorzystujące więcej niż jeden typ prekursora.

Na przykład CsTPS19DK produkował głównie limonen i beta-mircen po dostarczeniu GPP, ale wytwarzał seskwiterpen aromadendren jako główny produkt po dostarczeniu FPP. CsTPS23DK produkował głównie beta-ocymen z GPP, ale generował również alfa-farnezen i maalien po podaniu FPP. CsTPS26DK produkował głównie beta-elemen z FPP, natomiast CsTPS37DK generował nerolidol i farnezol.

Badacze doszli do wniosku, że ta elastyczność pomaga wyjaśnić, w jaki sposób konopie mogą generować wyjątkowo zróżnicowaną gamę terpenów bez konieczności posiadania oddzielnego enzymu dla każdego związku. Ich analiza wskazała, że syntazy terpenowe konopi mogą uzyskiwać co najmniej 12 różnych klas strukturalnych seskwiterpenów.

Ewolucja i duplikacje genów: klucz do bogactwa terpenowego

Analiza ewolucyjna dostarczyła kolejnej wskazówki. Konopie i chmiel, które należą do tej samej rodziny roślin, posiadają znacznie bardziej rozbudowane rodziny syntaz terpenowych w porównaniu z morwą, rośliną spokrewnioną. Badacze zidentyfikowali około 41 pełnodługościowych genów u konopi i 49 u chmielu, w porównaniu z zaledwie 12 u morwy. Konopie posiadały również 18 genów TPS-b, w porównaniu z dziewięcioma u pomidora i sześcioma u Arabidopsis.

Zdaniem badaczy powtarzające się duplikacje genów, po których następowały zmiany w sposobie regulacji tych genów oraz w reakcjach, jakie mogą przeprowadzać ich enzymy, wydają się być główną siłą napędową niezwykłego bogactwa różnorodności terpenowej konopi.

Dlaczego ekspresja genów nie zawsze przekłada się na stężenia terpenów?

Co istotne, badacze stwierdzili, że ekspresja genów nie przewidywała idealnie stężeń terpenów. Większość związków wytwarzanych przez testowane enzymy została również wykryta w rzeczywistych próbkach konopi, ale ilość i rozmieszczenie tych związków nie zawsze zgadzały się z ekspresją odpowiadających im genów.

Sugeruje to, że na profile terpenowe wpływa kilka współdziałających czynników, w tym dostępność materiału prekursorowego, enzymy zdolne do wytwarzania wielu produktów, nakładające się funkcje różnych enzymów oraz późniejsze chemiczne modyfikacje terpenów po ich wytworzeniu.

Znaczenie dla upraw i badań nad interakcją terpenów z kannabinoidami

Odkrycia te mogłyby się ostatecznie okazać przydatne dla growerów poszukujących kultywarów o określonych profilach aromatycznych lub badaczy próbujących manipulować produkcją terpenów. Autorzy twierdzą, że lepsze funkcjonalne mapy genów terpenowych mogłyby wspierać hodowlę wspieraną markerami oraz inżynierię metaboliczną mającą na celu zwiększenie, zmniejszenie lub inną modyfikację określonych lotnych związków. Dodali również, że praca ta mogłaby pomóc w badaniu postulowanych interakcji terpen-kannabinoid oraz potencjalnych efektów otoczenia (entourage effects).

Ograniczenia badania i kierunki przyszłych prac

Istnieją ograniczenia. Nowo scharakteryzowane enzymy testowano głównie w inżynieryjnych komórkach drobnoustrojów, a nie w roślinach konopi; badacze nie określili szczegółowej kinetyki enzymatycznej ani nie przetestowali każdego możliwego prekursora, a jedynie część wcześniej niescharakteryzowanych syntaz terpenowych mogła zostać poddana testom funkcjonalnym. Autorzy zauważają również, że konkurencja i koordynacja między szlakami kannabinoidowymi i terpenowymi, szczególnie w warunkach stresu środowiskowego, pozostają słabo zrozumiane.

Badacze konkludują, że połączenie genetyki, ekspresji genów, funkcji enzymów i pomiarów terpenów dostarcza ram do zrozumienia, w jaki sposób konopie wytwarzają swoją ogromną różnorodność aromatów i lotnych związków, jednocześnie potencjalnie umożliwiając hodowcom bardziej precyzyjne projektowanie przyszłych odmian pod kątem określonych cech chemicznych.

Przeczytaj na Soft Secrets także o:

Czy rośliny wykorzystują zielone światło do fotosyntezy?

Rewegetacja konopi. Jak przywrócić wzrost po kwitnieniu?

Księżyc a wzrost roślin. Co naprawdę mówi nauka?