Obtención de plantas libres de virus

Los virus son diminutos agentes infecciosos que sólo pueden reproducirse utilizando los mecanismos de replicación celular de otro organismo, por lo que son parásitos intracelulares obligados. Por lo general son de tamaño submicroscópico, es decir, son tan pequeños que ni siquiera pueden verse a través de un microscopio óptico convencional, sino que su observación requiere el uso de un microscopio electrónico.

Una partícula vírica completa, denominada virión, está compuesta por los siguientes elementos:

• Cápside: Una cubierta formada por subunidades proteicas denominadas capsómeros, con funciones de contención y protección del genoma vírico.

• Ácido nucleico: Ácido ribonucleico (ARN) o desoxirribonucleico (ADN), donde reside la información genética del virus, necesaria para la codificación de las proteínas que constituyen la cápside, así como las proteínas no estructurales, necesarias para la replicación del virus dentro de la célula.

• Membrana lipídica: Derivada de la membrana celular del huésped, envuelve la cápside y sólo está presente en algunos virus de animales.

La morfología de los viriones es muy diversa, aunque puede clasificarse en cuatro grupos principales:

• Helicoidal: Cuya cápside está compuesta por un único tipo de capsómero, agrupado sobre un eje central formando una estructura en forma de hélice. Tienen apariencia de hilo o de barra, como es el caso del virus del mosaico del tabaco.

• Icosaédrica: Su cápside tiene estructura poliédrica regular, formada por 20 caras triangulares, por lo que su apariencia es prácticamente esférica.

• Envuelta: Su cápside está rodeada por un envoltorio vírico cuya función es la de ayudar al virus a penetrar en la célula huésped, ya que al fusionarse con su membrana, permite la entrada de la cápside y el genoma vírico.

• Compleja: Su cápside tiene una parte icosaédrica y otra helicoidal, aunque puede poseer estructuras adicionales.

Ciclo reproductivo

El ciclo reproductivo de los virus varía mucho según la especie, pero puede resumirse en 6 etapas básicas:

• Fijación: Es la unión específica de la proteínas de la cápsula con algunos receptores de la superficie celular. Esta especificidad determina el rango de huéspedes que el virus puede infectar.

• Penetración: Se produce por endocitosis, un mecanismo celular de absorción de moléculas, fusión de membranas o por daño mecánico. En el caso de las plantas, cuyas paredes celulares son rígidas debido a que están compuestas por celulosa, la mayoría de los virus sólo pueden entrar por daño mecánico y una vez dentro, pueden desplazarse a través de los plasmodesmos, unos tubos microscópicos que unen unas células vegetales con otras, o a través del floema (movimiento sistémico).

• Desensamblado: Es el proceso por el cual la cápside es eliminada por la acción de enzimas proteolíticas (que degradan proteínas) o por disociación, liberándose el ácido nucleico.

• Replicación: Principalmente es la reproducción del genoma vírico utilizando las enzimas de replicación de ADN de la célula huésped. También se sintetizan las proteínas necesarias para formar la cápside.

• Ensamblaje: Es la unión de todos los elementos sintetizados para dar lugar a nuevos individuos.

• Liberación: Es el proceso de salida de la célula.

Transmisión

Los virus se transmiten a través de vectores biológicos, agentes que sirven de medio de transporte entre dos organismos, uno infectado y otro sano.

En el caso de las plantas los más importantes son:

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Insectos: Es el vector más habitual. Existen dos tipos de insectos fitopatógenos: aquellos que absorben la savia de la planta, como la mosca blanca o el pulgón, y aquellos que se alimentan del contenido celular, como los trips. Si la planta de la que se alimentan está infectada, absorberán partículas víricas junto con estas sustancias. En algunos casos es necesario un periodo de latencia, donde el virus se reproduce dentro del insecto, aumentando la carga viral y aumentando la posibilidad de que el insecto se haya trasladado a otra planta.

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Ácaros: Como la araña roja, que se alimenta de contenido celular al igual que los trips.

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Savia: La transferencia de savia infectada por medios mecánicos también es muy común. Por eso es importante desinfectar con alcohol las tijeras de poda entre su uso en una planta y otra.

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Nematodos: Son animales similares a los gusanos, normalmente microscópicos y  que poseen un estilete: una especie de aguja con la que succionan los vasos conductores, normalmente de las raíces.

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Hongos: Algunos hongos fitófagos son capaces de transmitir virus.

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Semillas y polen: En algunos pocos casos, los virus son capaces de transmitirse de una planta a las semillas generadas por ésta o a través de partículas de polen.

Respuesta inmune del huésped

Los animales poseen tres mecanismos de reacción ante un ataque vírico:

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La fiebre: Los virus son termosensibles, por lo que el aumento de la temperatura disminuye su replicación.

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El sistema inmunológico: Los linfocitos T coordinan la respuesta, los linfocitos B liberan anticuerpos específicos contra las proteínas virales, y las células NK (Natural Killer) destruyen las células infectadas.

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Los interferones: Son normalmente reguladores del crecimiento celular, que inducen procesos y enzimas que inhiben la replicación.

Desgraciadamente las plantas carecen de estos mecanismos, por lo que si son infectadas, lo estarán para el resto de su vida.

Métodos de control

Los métodos de control son de especial importancia si se mantienen genotipos en forma de plantas madre, ya que todos los esquejes extraídos de una planta infectada también lo estarán. Además, la infección de una sola de ellas pone en peligro a todas las demás.

Debido a que no existe ningún producto fitosanitario que cure un virus de una planta, los métodos se centran en el control de los vectores, para prevenir posibles infecciones.

Prestaremos la mayor atención al control de insectos y ácaros, al ser los vectores más comunes. Para ello no introduciremos en nuestra cámara madre aquel material vegetal que pudiera contener insectos, como son las plantas que crecen en el exterior. Además, instalaremos una malla antiinsectos en las entradas de aire de la cámara, y a ser posible, en las ventanas del edificio.

También desinfectaremos y pondremos en cuarentena, todo material vegetal nuevo que vayamos a introducir, ya que podría contener insectos o huevos de los mismos. Una cámara de crecimiento específica para tal efecto, aislada y situada en otro sitio, es la forma ideal de poder mantener las nuevas plantas hasta asegurarnos de que no contienen insectos. Para la desinfección utilizaremos insecticidas, aplicados periódicamente en caso necesario.

Para evitar una posible transmisión por savia infectada, desinfectaremos nuestras manos y todo el material susceptible a tener contacto con la misma, después de podar o esquejar una planta.

En el caso del control de nematodos, como en su gran mayoría viven en el suelo, utilizaremos siempre sustratos profesionales de buena calidad, evitando siempre tierra del campo, del parque, del jardín o sustratos de dudosa procedencia.

Por último, aunque los casos de transmisión por semillas y polen son muy escasos, se pueden eliminar aquellas plántulas de crecimiento enfermizo y las preflores que puedan surgir en nuestras plantas madre, por si acaso.

Síntomas

Las enfermedades producidas por los virus suelen manifestarse mediante una serie de síntomas como son la aparición de variegados, manchas amarillas, deformaciones, abultamientos, enrollamiento de los bordes de las hojas, crecimiento pobre y enfermizo, y tendencia al enanismo.

Los virus son sistémicos, por lo que se encuentran en todos los tejidos de la planta, pero los síntomas pueden mostrarse sólo en algunas partes.

La sintomatología puede variar mucho de un virus a otro, incluso de una planta a otra, habiendo plantas que no muestren ningún síntoma, a pesar de contener virus y tener capacidad infecciosa.

Diagnostico

Si la planta presenta síntomas puede llegar a deducirse que estos son debidos a una infección vírica e incluso identificar el agente vírico que los causa, pero puede darse el caso de que la infección sea por más de un sólo virus. En estos casos, resulta imposible aislar unos síntomas de otros. Además, los síntomas pueden confundirse con otros, provocados por factores ambientales o por carencias nutricionales.

Debido a estos problemas y al que provocan los individuos carentes de síntomas, el método de diagnóstico de virus en vegetales más utilizado es el DAS-ELISA, Double Antibody Sandwich Enzyme-linked Immunosorbent Assay o ensayo por inmunoabsorción ligada a enzimas de doble anticuerpo. El método, a grandes rasgos, consiste en lo siguiente:

Una vez se ha aislado e identificado una especie de virus, éste se inocula en una planta sana para que se reproduzca. A continuación, se extrae una muestra de savia o se hace una pasta de hoja, con la que se prepara una disolución en agua. Dicha disolución es inyectada mediante una aguja hipodérmica en un mamífero, normalmente un conejo o una rata, que desarrollará una respuesta inmunológica contra el virus.

En el momento en el que el animal haya producido una buena cantidad de anticuerpos específicos contra el virus, se le extrae una muestra de sangre y se aíslan. Estos anticuerpos tienen forma de “Y” y tienden a fijarse a los viriones, desactivándolos. Parte de estos anticuerpos se marcan con una enzima.

Luego se prepara una placa microtituladora de plástico, con pocillos tratados para aumentar su adsorción de proteínas, para que la parte no reactiva de los anticuerpos no marcados quede adherida a su fondo. Posteriormente se lava para eliminar los restos de anticuerpos no adheridos.

A continuación se introduce la muestra a analizar, que puede ser una disolución de savia. Si la muestra contiene viriones específicos, estos quedarán retenidos a los anticuerpos de la placa.

Después de volver a limpiar la placa, se introducirán los anticuerpos marcados, que quedarán fijados a los viriones en caso de encontrarse.

Finalmente, se vuelve a limpiar la placa y se adiciona un sustrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. El resultado de dicha reacción debe mostrar un color característico que identifique la muestra como positiva. Para medir la cantidad de concentración del virus, se utiliza un electrofotómetro, un aparato que mide la cantidad de radiación adsorbida cuando ésta atraviesa la muestra.

Cultivo de meristemos

Como hemos visto previamente, las plantas no poseen ningún sistema defensivo efectivo contra los virus y además, no existe ningún producto capaz de eliminarlos sin matar al huésped.

Sin embargo, sí que se pueden aislar células sanas, que todavía no hayan sido invadidas, y cultivarlas en medio estéril hasta que formen un nuevo individuo sano. Estas células se encuentran en los meristemos, de los que ya hablamos en otra ocasión.

Los meristemos son zonas de crecimiento activo, donde células sin diferenciar están constantemente multiplicándose por mitosis, para que posteriormente algunas de ellas se diferencien a células especializadas y el resto continúen sin diferenciar, multiplicándose indefinidamente. Como en ellos todavía no se han diferenciado tejidos conductores ni plasmodesmos, la mayoría de los virus serán incapaces de llegar.

Aquellos más fáciles de obtener son los que se encuentran en el ápice de los brotes, ocultos entre las pequeñas hojas en desarrollo. Aun así, su obtención es complicada porque tienen una longitud de unos 2 mm, y su posibilidad de supervivencia es muy limitada debido a que no poseen hojas. Es frecuente que antes de su obtención se trate la planta madre con calor para reducir, en la medida de lo posible, la replicación vírica y aumentar las posibilidades de éxito.

La composición del medio de cultivo varía mucho entre especies, incluso entre genotipos de la misma especie, pero por lo general, se utilizan concentraciones muy bajas de reguladores del crecimiento.

Los explantos que sobrevivan comenzarán a formar tallos y hojas. Una vez hayan alcanzado el crecimiento suficiente pueden ser subcultivados indefinidamente o enraizados para formar plantas completas.

Llegados a este punto, será necesario hacer un diagnóstico a todas las plantas obtenidas de esta forma, para seleccionar aquellas que realmente estén libres de virus, ya que al obtener los meristemos se ha podido coger alguna célula contaminada.